在操作高效液相色谱仪时,色谱柱是在室温环境下工作的。大多数的工作环境温度是不断变化的，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的,高效液相色谱仪方法中的洗脱方式受温度的影响。高效液相色谱仪等度洗脱时温度会影响保留时间，当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高1C，保留时间会缩短(1~3)%。温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响。即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般也会有较大的变化。温度变化还可能弓|起选择性显著变化。
正如高效液相色谱仪柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。
 
当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外,峰宽也会发生变化。升高温度通常会使理论塔板数升高,峰宽变窄,由于峰面积不变,峰越窄就会越高，因此升高温度可以达到更小的检测限。高效液相色谱仪柱子里的温度变化也会影响峰形。当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。
 
为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办法。如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔.绝在一个温度波动最小的地方。
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